數字PCR

數字PCR技術是繼一代普通PCR、二代熒光定量PCR之后的第三代PCR技術。其原理是將含有核酸分子的反應體系制成成千上萬個納升級的微滴,其中每個微滴不含待檢核酸靶分子,或者含有一個至數個待檢核酸靶分子,且每個微滴都作為一個獨立的 PCR 反應器,經PCR 擴增后采用微滴閱讀儀逐個對每個微滴進行檢測。有熒光信號的微滴判讀為 1;沒有熒光信號的微滴判讀為 0,因此該技術被稱為數字PCR。最終根據泊松分布原理以及陽性微滴的比例,分析軟件可計算給出待檢靶分子的濃度或拷貝數。數字PCR 是一個全新的絕對定量方式,與傳統 PCR定量 PCR 相比:其結果的精確度、準確性和靈敏度更佳、定量的結果不再依賴于 Ct 值,直接給出靶序列的起始濃度,實現真正意義上的絕對定量,將帶來了前所未有的精確性和靈敏度,可以說是開啟了一場核酸定量技術的革命。在未來,數字PCR在分子診斷領域會發揮更大的作用,數字 PCR 特別適合應用于拷貝數變異、突變檢測、基因相對表達研究等,并對遺傳病、癌癥、傳染病、產前診斷的研究提供了一種全新的技術思路與手段,具有廣泛的、不可替代的應用前景。

可廣泛應用于DNA的定量與定性檢測,尤其是在直接絕對定量、低豐度模板檢測、細微差異檢測、稀有變異檢測有巨大的優勢。在低拷貝靶分子、模板濃度差異細微條件下, qPCR靈敏度和精確度到了極限,而數字PCR可以輕易完成檢測!

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ddPCR workflow2

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數字PCR技術原理

微滴式數字PCR系統在傳統的PCR擴增前對樣品進行微滴化處理,即將含有核酸分子的反應體系分成數萬個納升級的微滴,其中每個微滴或不含待檢核酸靶分子,或者含有一個至數個待檢核酸靶分子。經PCR擴增后,對每個微滴的熒光信號進行逐一分析,有熒光信號的微滴判讀為1,沒有熒光信號的微滴判讀為0,根據泊松分布原理及陽性微滴的個數與比例即可得出靶分子的起始拷貝數或濃度。

通過把樣本稀釋成許多部分,然后在一個反應發生的時候對其進行計數。其靈敏度高達0.001%,顯著高于擴增阻滯突變系統(0.1%)和Sanger法測序(10%)。同時能克服核酸降解的不利影響,非常適合一些稀有樣本中核酸的精確檢測。

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平臺優勢

更特異? –? 單分子水平擴增,稀有分子信號不會再被覆蓋

更簡便? –? 直接絕對定量,不再依賴擴增曲線、內參基因、標準品

更靈敏? –? 檢測稀有模板與細微差異,分辨率達0.001%

更精確? –? 不受擴增效率影響,通過終點信號計算濃度

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技術流程

基因ORF序列信息提供→實驗方案選擇→客戶確認→引物、探針合成→數字PCR擴增→數字PCR芯片讀取→數據整理→報告生成。